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模式與轉基因動物
完全性基因敲除鼠

時間:2020-07-17 16:47:00 瀏覽:1986次


技術原理:

CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)最新出現的一種由RNA指導Cas核酸酶對靶向基因進行特定DNA修飾的技術。CRISPR是細菌和古細菌為應對病毒和質粒不斷攻擊而演化來的獲得性免疫防御機制。在這一系統中,crRNA(CRISPR-derived RNA)通過堿基配對與tracrRNA(trans-activating RNA)結合形成雙鏈RNA,此tracrRNA/crRNA二元復合體指導Cas9蛋白在crRNA引導序列靶定位點剪切雙鏈DNA達到對基因組DNA進行修飾的目的。CRISPR/Cas9系統能夠對小鼠和大鼠基因組特定基因位點進行精確編輯, 目前已經成功應用于大、小鼠基因KO/KI的模型制備。


技術特點:

(1)無物種限制

(2)靶向精確性更高

(3)可實現對靶基因多個位點同時敲除

(4)基因調控方式多種多樣

(5)修飾效率高,實驗周期短

通過CRISPR /Cas9基因敲除技術,針對靶基因設計和構建gRNA與Cas9表達質粒,造成目的基因的功能區域被敲除,獲得全身所有的組織和細胞中都不表達該基因的小鼠模型 。


移碼突變鼠的建系原則與流程

1、通過針對靶基因設計、構建相應的gRNA質粒,體外轉錄為RNA后,與Cas9 mRNA一起原核顯微注射獲得測序鑒定陽性的F0代雜合子鼠;

2、F0代雜合子鼠與野生型鼠進行交配,獲得PCR和測序鑒定陽性的F1代雜合子鼠;

3、選擇來自同一只F0代鼠,基因型一致的F1代鼠,達到性成熟后進行互配,可獲得F2代鼠。對獲得的F2代鼠進行PCR及測序鑒定,理論上,F2代鼠中25%為純合子, 50%為雜合子,25%為野生鼠。


片段基因敲除鼠的建系原則與流程

1、通過針對靶基因不同位點設計、構建相應的一對gRNA質粒,體外轉錄為RNA后,與Cas9 mRNA一起原核顯微注射獲得測序鑒定陽性的F0代雜合子鼠;

2、F0代雜合子鼠與野生型鼠進行交配,獲得PCR鑒定陽性的F1代雜合子鼠;

3、選擇來自同一只F0代鼠,基因型一致的F1代鼠,達到性成熟后互配,可獲得F2代鼠。對獲得的F2代鼠進行PCR及測序鑒定,理論上,F2代鼠中25%為純合子,50%為雜合子,25%為野生鼠。


雙(多)基因敲除鼠的建系原則與流程

1、通過針對兩個靶基因分別設計、構建相應的gRNA質粒,體外轉錄為RNA后,與Cas9 mRNA一起原核顯微注射獲得測序鑒定陽性的F0代多基因雜合子鼠;

2、F0代雜合子鼠與野生型鼠進行交配,獲得PCR和測序鑒定陽性的F1代雙基因雜合子鼠;

3、選擇雙基因雜合子鼠進行雜交,獲得F2代鼠。對獲得的F2代鼠進行PCR及測序鑒定。

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